Culture cellulaire et lignées, modèles in vitro et ex vivo

La culture cellulaire, un outil indispensable aux biotechnologies

La culture cellulaire désigne l’ensemble des techniques utilisées pour faire vivre des cellules dans un milieu de culture différent de celui d’origine. Ces modèles in vitro peuvent être des bactéries, des levures, ou des cellules d’origine animale.

Cultiver des cellules in vitro et obtenir des lignées cellulaires a pour but d’en disposer pour la production de molécules organiques ou pour l’expérimentation. Qu’il s’agisse d’une culture primaire ou non, il est par ailleurs indispensable d’identifier les bonnes conditions de culture cellulaire : un environnement stérile, afin de limiter la compétition entre différents types cellulaires ; un milieu de culture fournissant les éléments nécessaires à la croissance des cellules ; et des conditions de survie favorables aux cellules en termes de température, de concentration en oxygène et en dioxyde de carbone.

Quels sont les avantages à passer par un prestataire pour des tests sur culture cellulaire ou pour une production d’hiPSC ?

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Tests in-vitro sur cultures cellulaires

Les tests en conditions in vitro sont réalisés en culture cellulaire. Ces tests permettent d’étudier des fonctions et phénomènes biologiques : à chaque type de test correspond une fonction ou mécanisme. Cela s’applique notamment à la migration cellulaire, la viabilité ou la réponse immunitaire, les tests existants sont adaptés en fonction des projets.

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Tests ex-vivo sur explants

Les tests in-vitro sur cellules en culture peuvent parfois présenter des limites sur leur représentativité des conditions physiologiques. Les tests in-vivo sur modèles animaux sont plus complexes et onéreux à mettre en place, et posent des questions éthiques. Les test ex-vivo sur explants de tissus sont un moyen de tester en conditions plus proches de la réalité physiologique.

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Préparation de lignées cellulaires

Les cellules primaires sont isolées directement de tissus d'organismes vivants et sont ainsi utilisés comme modèles de l’état physiologique in vivo. Une culture primaire n’est pas immortelle et subit donc le phénomène de senescence : le vieillissement des cellules. Pour maintenir ces cellules, certaines conditions de culture doivent être respectées.

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Préparation de lignées primaires

Les cellules primaires sont isolées directement de tissus d'organismes vivants et sont ainsi utilisés comme modèles de l’état physiologique in vivo. Une culture primaire n’est pas immortelle et subit donc le phénomène de senescence : le vieillissement des cellules. Pour maintenir ces cellules, certaines conditions de culture doivent être respectées.

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Purification d'organelles

Les organelles sont les composants cellulaires telles que lex noyaux, les mitochondries ou les ribosomes. L’isolation de ces composés est parfois nécessaire pour leur étude. Pour cela, plusieurs techniques sont possibles, comme la séparation par gradient de densité (centrifugation) ou la purification par affinité (chromatographie).

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Remplacer le test sur modèle animal par les tests ex vivo et in vitro

In vivo (du latin « dans le vivant ») est une expérimentation utilisant un organisme vivant entier par opposition à un organisme partiel ou mort, ou un environnement contrôlé in vitro. L'expérimentation animale et les essais cliniques sont deux formes de recherche in vivo. Les tests in vivo sont historiquement utilisés de préférence aux tests in vitro parce qu'ils sont mieux adaptés à l'observation des effets globaux d'une expérience sur un sujet vivant, et peuvent être requis dans le cadre réglementaire.

Ex vivo (du latin : « hors du vivant ») désigne ce qui se passe à l'extérieur d'un organisme. En science, ex vivo se réfère à l'expérimentation ou aux mesures effectuées dans ou sur des tissus dans un environnement artificiel à l'extérieur de l'organisme avec un minimum d'altération des conditions naturelles. Un test ex vivo largement répandu est le test de la membrane chickchorioallantoïde (CAM). D’autres études sur explants de peau sont couramment utilisées en recherche et développement de produits cosmétiques.

Les tests in vitro (latin : « dans le verre ») en biologie expérimentale sont ceux qui sont menés en utilisant des composants d'un organisme qui ont été isolés de leur environnement biologique habituel. La culture cellulaire en fait ainsi partie. La culture in vitro tridimensionnelle (3D) s’est grandement développée ces dernières années, notamment par l’utilisation de gel matrice. La culture 3D est plus représentative de l’environnement in vivo, notamment dans les interactions cellules-cellules. Des modèles in vitro complexes de reconstruction existent, comme les modèles d’épidermes reconstruits.

Comment passer du modèle in vivo aux modèles alternatifs ?

  1. Développer des solutions alternatives pertinentes – un panel de tests pour répondre aux questions aujourd’hui adressée uniquement sur l’animal
  2. Diminuer les coûts des modèles ex vivo ou in vitro complexes
  3. Préparer la transition au niveau réglementaire

Les lignées cellulaires : critères de sélection

Les lignées cellulaires sont à la base des travaux de recherches de nombreux laboratoires. Leur choix est crucial et doit être fait de façon éclairée, en prenant compte des critères suivants.

Authenticité de la lignée

Il existe plus de 400 lignées cellulaires mal identifiées enregistrées dans une base de données spécifique.

Il est donc important, lorsque vous commencez avec une nouvelle lignée cellulaire, d'être certain qu'elle est ce que vous croyez qu'elle est. Assurez-vous d'obtenir votre lignée cellulaire auprès d'une banque de cellules de confiance telle que l'ATCC, DSMZ or ECACC.

Vérifier la contamination

Malgré le risque de résultats erronés ou non reproductif lié à une infection d’une culture cellulaire par mycoplasme, elles sont souvent négligées, en raison de la taille du micro-organisme et de leurs différences structurelles par rapport aux autres bactéries. De nombreux tests existent cependant pour vérifier l’absence de mycoplasme : PCR, ELISA, marquage ADN, tests de croissance, etc.

Préférer un nombre de passage faible

Les lignées cellulaires ont une certaine instabilité génétique : à chaque division, des erreurs s’intègrent dans le génôme des cellules, ce qui créé des différences au fil du temps. Celles-ci sont régulièrement mises en évidence en comparant les profils de lignées primaires et de culture cellulaires équivalentes ayant subi un nombre de passage élevé. Les bonnes pratiques incluent de repartir d’un stock de cellules correspondant à faible passage régulièrement (2-3 mois, selon les lignées), et de bien référencer le nombre de passage estimé à chaque expérimentation.

A chaque question biologique, une lignée cellulaire à privilégier ?

Si la question biologique peut se rapprocher d’une pathologie particulière, alors il est indispensable de choisir la lignée cellulaire qui deviendra alors « modèle » de la maladie. Cependant, le choix aussi critique soit-il, n’est pas toujours évident. Pour commencer ses recherches, l’encyclopédie des lignées cellulaires cancéreuses (Cancer Cell Line Encyclopaedia, CCLE) fourni un accès public à des données génétiques pour environ 1000 lignées et permet d’orienter ses choix.

L’autre source de référence est la base de données COSMIC (Catalogue of Somantic Mutations in Cancer), qui fournit également des données sur les mutations des lignées cancéreuses.

Si la question biologique est indépendante indépendante d’une pathologie particulière, alors les souches de références sont typiquement celles utilisées lors de travaux de recherche précédent. Cette approche introduit cependant un biais, puisque certaines lignées sont favorisées. La solution scientifique appropriée pourrait être par exemple de tester plusieurs lignées sur un test déjà validé, ce qui renforce la pertinence des observations faites sur une lignée utilisée pour l’ensemble de l’étude.

Retrouvez notre article de blog sur les cellules HeLa pour en apprendre plus sur cette lignée cellulaire aux 75 000 articles scientifiques !

Types de prestataires

De multiples acteurs interviennent dans la culture cellulaire : des sociétés de service, des banques de cellules, et des plateformes académiques spécialisées

Les sociétés de services

De nombreuses sociétés de services produisent des outils pour la culture cellulaire tels que les explants, les milieux de culture spécifiques. Les sociétés spécialisées peuvent également générer des lignées stables ou des cellules pluripotentes induites (IPSCs) et effectuer des tests sur ces dernières.

Les banques de cellules

Les lignées primaires et les lignées cellulaires sont typiquement fournies par des banques de cellules privées ou publiques.

Les structures académiques

Des plateformes académiques spécialisées en biologie cellulaire proposent des tests in vitro, selon leur spécialité.

Pourquoi une culture primaire s’arrête (ou continue) de pousser ?

La culture cellulaire primaire est la dissociation des cellules d'un tissu parental animal ou végétal par des mesures enzymatiques ou mécaniques et le maintien de la croissance des cellules dans un substrat approprié, dans des récipients en verre ou en plastique, dans des conditions environnementales contrôlées.

Les cellules issues de cultures primaires ont une durée de vie limitée. Les cellules ne peuvent être conservées indéfiniment pour plusieurs raisons. L'augmentation du nombre de cellules dans la culture primaire entraînera l'épuisement du substrat et des nutriments. De plus, l'activité cellulaire augmentera progressivement le niveau de métabolites toxiques dans la culture, ce qui empêchera la croissance des cellules.

Les cellules peuvent alors être remises en suspension et placées dans un nouveau milieu, éliminant ainsi les métabolites toxiques. C’est ce qui constitue une culture secondaire, le but est de générer un nombre de cellule plus important, et de maintenir les cultures en vie. Cependant il existe un risque que les cellules évoluent et se transforment, ou acquièrent des modifications génétiques. Une capacité d’analyse et d’interprétation déterminera la qualité du test.

Les technologies utilisées

Clonage et transfection

Prélèvement sur organisme

Microscopie

Lecteur de plaques

Méthodes séparatives - centrifugation

Tarifs estimés pour ce type de prestation

150 € - 1 500 € par lignées cellulaire ou culture primaire
Un test in vitro typiquement a un tarif à partir de 1 000 €
Un test sur explant commence à partir de 8 000 € - 10 000 €