Services en protéomique : étude des protéines et analyses protéomiques

Définition de la protéomique et ses applications

La protéomique est l’étude de l’ensemble des protéines et marqueurs protéiques d’un organisme, d’un organe, d’une cellule et même d’un compartiment cellulaire. Cette étude se fait par des analyses protéomiques utilisant des techniques spécifiques, comme la spectrométrie de masse en protéomique. Les protéines sont le résultat direct de l’expression du génome ; ce sont ainsi les protéines qui différencient et confèrent des caractéristiques spécifiques à deux organismes distincts.

La protéomique répond à plusieurs niveaux des questions sur les protéines :

  • Quelles protéines sont présentes dans un échantillon ? Des millions de protéines différentes existent dans chaque cellule, issues de la traduction du génome, et des modifications post-traductionnelles : phosphorylation, troncation, ubiquitination, etc.
  • Quelle quantité de protéines d’intérêt un échantillon contient-il ? Certaines protéines peuvent être très abondantes dans une cellule, tandis que d’autres seront difficilement détectables.
  • Quelle est la structure de la protéine ou le complexe ? Quatre niveaux de structure protéique existent : la succession d’acides aminés (primaire), les éléments de structure fondamentaux en hélices alpha et feuillets beta (secondaire), le repliement tridimensionnel à l’aide de liaisons covalentes ou non-covalentes (tertiaire), et l’intégration de la protéine dans un complexe (quaternaire).
  • Quel est l’état biologique de la protéine d’intérêt : modifications, partenaires ? Certaines protéines connaissent de profondes modifications au cours de son existence : phosphorylations et déphosphorylations, troncations, dégradations, etc.

Quels sont les avantages à passer par un prestataire pour des analyses protéomiques ?

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Détection de protéines et d’anticorps

Les techniques classiques de détection de protéines spécifiques dans un échantillon reposent sur l’immunodétection, c’est-à-dire la détection de l’affinité d’un anticorps pour son antigène. Ainsi, un test utilisant un anticorps dirigé contre une protéine indiquera la présence ou l’absence de cette protéine. C’est le cas, par exemple, des techniques ELISA ou Western blot.

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Identification de peptides et protéines

Il existe une grande variété de protéines constamment synthétisées, modifiées et dégradées. Cette diversité contribue aux mécanismes complexes qui ont lieu de façon intra et extracellulaires. L’identification des protéines présentes dans un échantillons sont donc une des clés pour comprendre le fonctionnement des cellules.

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Marquage d'anticorps et de protéines

La conjugaison de protéines ou peptides avec des marqueurs est très utile pour la détection ainsi que pour l’étude de structure et des interactions avec d’autres molécules. Par exemple, les marqueurs peuvent être fluorescent pour une analyse en imagerie, ou peuvent être effectués pour produire des conjugués médicaments-anticorps (ADC).

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Quantification de protéines

Pour déterminer la quantité d’une protéine donnée dans un échantillon, des techniques immunochimiques peuvent être utilisées, telles que la méthode ELISA ou le Western Blot. Des techniques analytiques telles que la spectrométrie de masse quantitative ou le microarray (mesure d’interaction avec d’autres molécules comme des peptides) sont aussi possibles.

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Structure de protéines

La structure tridimensionnelle d’une protéine a un lien direct sur sa fonction, c’est pourquoi les analyses structurales des protéines sont importantes. Une des méthodes couramment utilisées pour déterminer la structure tridimensionnelle de protéines est l’analyse par rayons X de cristaux protéiques. Cette méthode donne des informations très précises sur la structure des protéines.

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Les technologies de pointe en protéomique

Single cell proteomics

Alors que les techniques single cell en génomique arrivent à maturité, les méthodes d’analyse protéomique de cellules uniques se développent encore. La façon dont le protéome exprimé diffère d'une cellule à l'autre est une question critique, qui complète la question adressée par la génomique. La spectrométrie de masse - la technique de pointe de la protéomique - permet de détecter et quantifier des protéomes presque complets, en partant de dizaines de milliers de cellules ou plus. Inversement, la technique de cytométrie de masse permet de quantifier des protéines, mais uniquement en nombre restreint et sur les protéines suffisamment abondantes.

Dans une cellule typique de mammifère, une analyse protéomique fiable par spectrométrie de masse n'a été possible que pour les marqueurs protéiques et protéines les plus abondants. De nouvelles approches pourraient bientôt apporter des changements. Les capteurs nanoporeux, une technologie désormais bien établie pour le séquençage de l'ADN et de l'ARN au niveau des cellules individuelles, sont également étudiés pour le séquençage des protéines.

Des approches immuno (détection par anticorps) pour le profilage des marqueurs protéiques et protéines dans les cellules uniques sont également de plus en plus appliquées à une plus grande échelle.

Targeted proteomics

La protéomique ciblée (Targeted proteomics) est une méthode générale de détection d’un ensemble de protéines d’intérêt. Cependant, les quelques années de pratique ont laissé la place à de grandes disparités d’approches, notamment en combinant plusieurs instruments (quadrupoles, orbitrop, MALDI-ToF). Plusieurs études ont donné lieu à de très beaux résultats.

Les quatre méthodes telles que classifiées par Eva Borràs et Eduard Sabidò sont les suivantes :

  • Selected ion monitoring (SIM) : il s’agit de filtrer le détecteur du spectromètre pour un peptide unique, utilisé pour la quantification. La quantification se fait en détection par seconde, et peut se faire séquentiellement sur plusieurs peptides.
  • Analyse ciblée au niveau peptidique (MS1) : l’acquisition des données est faite pour l’ensemble des peptides présents en solution sur la durée totale du gradient chromatique, ce qui crée une carte MS1 (MS1-Map).
  • Analyse ciblée au niveau de fragments ioniques (MS2) : une des stratégies majeures de la protéomique ciblée, la Selected reaction monitoring (SRM) utilise la triple quadrupole MS avec un filtre sur les peptides à suivre, qui seront ensuite analysés par un autre analyseur MS. Cette stratégie a un bruit de fond relativement faible et une sensibilité élevée.
  • Parallel reaction monitoring (PRM) : analyse simultanée de plusieurs fragments de peptide présélectionnés par un quadrupole pour isoler le peptide d’intérêt, puis un MS en mode criblage.

Discovery proteomics

La protéomique de découverte est l’étude et la découverte de marqueurs protéiques pour un test donné par la spectrométrie de masse. Le nombre d’échantillons testé dans un premier temps est relativement minime. Une fois ces marqueurs identifiés, ils sont utilisés à plus large échelle sur un plus grand nombre d’échantillons. Les progrès en discovery sont principalement liés à l’amélioration des instruments et des logiciels d’analyse.

Types de prestataires

Deux catégories majeures de prestataires en protéomique :

Les plateformes académiques

Les plateformes académiques sont sollicitées pour la protéomique nécessitant l’utilisation de matériel onéreux, ou demandant un développement de méthode. Les spectromètres de masse sont très difficiles à financer, ce que les structures académiques peuvent faire en se regroupant. Le service est rendu par une plateforme technologique disponible auprès de structures externes comme les instituts de recherche et les sociétés.

Les sociétés de service

Les sociétés de service en protéomique proposent des services adaptés aux demandes de clients privés ou publiques : identification, quantification, développement de méthode pour les tests cliniques. Elles peuvent être très spécialisées ou généralistes dans leurs analyses protéomiques, et peuvent valider des méthodes en utilisant les principes GLP (good laboratory practice).

Applications cliniques et diagnostiques de la protéomique

L'application de marqueurs protéiques (ou peptidiques) dans les études cliniques est un domaine dynamique en pleine expansion. L'introduction de la protéomique clinique, telle que les essais basés sur la spectrométrie de masse et les puces à protéines multiplexées à base d'anticorps, a remodelé le paysage de l'identification et de la validation des biomarqueurs, permettant la découverte de nouveaux marqueurs protéiques à un rythme et avec une fiabilité sans précédent.

Les méthodes utilisées sont typiquement la spectrométrie de masse quantitative (label-free ou SILAC / iTRAQ), l’électrophorèse capillaire couplée à la MS (CE-MS).

Les champs de recherche dans lesquels des analyses protéomiques sont en cours ou viennent de se terminer sont les suivants :

Analyse protéomique en oncologie

De nombreux marqueurs sont utilisés en oncologie, comme c’est le cas pour une étude clinique en cours sponsorisée par l’Institut du Cancer de Montpellier, qui mesure cinq protéines présentes dans le sang (adenylate kinase 2 (AK2), isocitrate dehydrogenase 2 (IDH2), annexin 1 (ANX1), DNA-apurinic or apyrimidinic site lyase (APEX1), and heat shock cognate 71 kDa (HSC70) ), et qui vont permettre de stratifier les groupes de patients et recommander des traitements en fonction.

Cet exemple est représentatif de l’utilisation de traitements existant à des doses différentes pour des sous-groupes de patients différents, et constitue une promesse pour la médecine personnalisée, qui permet de limiter certains effets secondaires, et d’être plus économique.

Analyse protéomique en dysfonction néphrologique

Les marqueurs protéiques présents dans les urines peuvent être identifiés et mesurés par les techniques de protéomique, comme c’est le cas pour les patients atteints de diabète de type 2, et présentant des risques de développer des néphropathies. Dans une étude portée par le Steno Diabetes Center Copenhagen qui a été finalisée, un cocktail de peptides (issus de protéines inflammatoires, fibrinogènes, apolipoprotéines, alpha-1 antitrypsin) est analysé par CE-MS dans les urines de 1777 patients, et un traitement standard vs spironolactone vs placebo est administré de façon aléatoire.

Analyse protéomique pour les maladies inflammatoires

Un marqueur protéique classique de l’inflammation, la protéine C-réactive (CRP), est mesuré dans l’objectif de stratifier des sous-groupes dans une cohorte de patients en observation médicale intensive pour des infections persistantes.

Analyse protéomique pour les maladies neurologiques

La protéine S100B est un biomarqueur standard des dommages cérébraux et a l’avantage d’être détecté de façon non invasive puisqu’elle se retrouve dans le sang après dysfonctionnement de la barrière hématoencéphalique. Ce marqueur protéique est au cœur de plusieurs études, notamment en parallèle de l’étude d’autres marqueurs comme les neuropeptides P et Y, le neurofilament triplet protein (NFL), ou dans le cadre de suivi de trauma crânien en comparaison de la tomographie crânienne.

Analyse protéomique pour les maladies cardiovasculaires

Dans le cas des maladies cardiovasculaires, un diagnostic précis et rapide est indispensable. Plusieurs études en cours font appel à la protéomique pour identifier différents marqueurs, comme le Fatty Acid Binding Protein (FABP), ou comme cette autre étude qui regarde 16 marqueurs cardiovasculaires différents à la fois (apolipoprotein B100, FABP3, L-selectin, atrionatri-uretic peptide receptor 1, insulin-like growth factor–binding protein 3, coagulation factor V [F5], F9, F10, adiponutrin, von Wille-brand factor, thrombospondin 1, prolactin, paraoxonase 3, epidermal growth factor receptor, vascular endothelial growth factor, henopexin, myeloblastin, plasma serine protease inhibitor, heparin cofactor II, hyaluronan-binding protein).

Les technologies utilisées

Extraction de protéines

Electrophorèse et Western Blot

ELISA et méthodes ELISA Multiplex

Immunoprécipitation et co-immunoprécipitation

Spectrométrie de masse

Peptide array

Cristallographie et difraction aux rayons X

Tarifs estimés pour ce type de prestation

Une analyse d’échantillons par spectrométrie de masse en protéomique peut coûter de quelques centaines d’euros à quelques milliers, en fonction de la complexité de l’échantillon et la mise au point de la méthode.

Une détermination de structure de protéine ou complexe peut aller de 3 000 € - 20 000 € d’euros pour la production de cristaux, et commence à quelques milliers d’euros pour l’acquisition et la détermination de structure.