Génomique : Séquençage NGS d'ADN et d' ARN, clonage et qPCR

Définition de la génomique et applications en biotechnologie

La génomique est la science qui étudie le génome des êtres vivants. L’étude du génome, au moyen de technologies comme le séquençage d’ADN par méthode Sanger ou le séquençage nouvelle génération (NGS), permet d’établir des cartographies, d’étudier les gènes et leurs fonctions, et notamment d’identifier des gènes responsables de maladies.

De nouveaux procédés ont permis à la génomique d’exploser ces dernières années ; parmi elles, le séquençage nouvelle génération, les techniques d’édition de génomes telles que CRISPR-Cas9, et les technologies quantitatives pour mesurer l’expression des gènes par qPCR et dPCR. Les méthodes de séquençage d’ADN génomique ont subi une évolution particulièrement marquée, que l’on peut classer selon leur génération d’apparition : méthode Sanger, de Maxam et Gilbert, séquençage nouvelle génération comprenant le pyroséquençage, le séquençage SOLiD, par Nanopore, etc.

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Comment fonctionne le Next-generation sequencing (NGS) ?

Aujourd’hui, les instruments et réactifs de recherche nous permettent des séquençages génomiques intégraux, qu’ils soient connus ou non, et de se focaliser sur des régions d’intérêt ou de séquencer l’exome de cellules isolées.

Comment la méthode Sanger, technique de séquençage développée dans les années 70 par le biochimiste britannique Frederick Sanger, a-t-elle évolué pour permettre ces avancées ?

La réponse réside dans la technologie massivement parallèle que propose le séquençage nouvelle génération (Next Generation Sequencing, NGS), ainsi que dans les progrès phénoménaux de la bioinformatique. On peut distinguer le séquençage de seconde et de troisième génération.

Le séquençage de l'ADN de deuxième génération réside sur une amplification parallèle. Des molécules d'ADN sont amplifiées dans une PCR en émulsion (emPCR). La ligature de l'adaptateur et la PCR produisent des banques d'ADN avec les extrémités 5′ et 3′ correspondantes, qui sont immobilisées sur des microbilles individuelles marquées par des oligonucléotides. Les conjugués bille-ADN peuvent ensuite être émulsifiés en gouttelettes d'émulsion ne contenant qu'une seule bille.

L'amplification clonale se produit alors pendant l’emPCR, chaque ADN matrice est physiquement séparé de tous les autres, les molécules filles restant liées aux microbilles. Alternativement, une amplification PCR peut produire des ponts et former des groupes de populations d'ADN clonaux dans une réaction en phase solide. Les banques produites par ces deux méthodes peuvent ensuite être lues de manière très parallélisée : les microbilles produites par emPCR peuvent être lavées sur une plaque de picotitrage, contenant des puits suffisamment grands pour contenir une seule bille. Les produits de cellules de flux issus de l'amplification en pont peuvent être visualisés en détectant les nucléotides terminateurs réversibles fluorescents aux extrémités d'une réaction d'extension en cours.

Le séquençage de troisième génération réside sur : un séquençage de molécule unique (Single molecule sequencing, SMS), un séquençage en temps réel, ou tout autre caractéristique variant du séquençage de deuxième génération. Deux exemples de fonctionnement :

  • La détection des nucléotides se fait dans un guide d'ondes en mode zéro (ZMW), comme dans les séquenceurs PacBio. Les molécules d'ADN polymérase sont fixées au bas de chaque ZMW, et l'ADN cible et les nucléotides fluorescents sont ajoutés. Comme le diamètre est plus étroit que la longueur d'onde de la lumière d'excitation, l'éclairage diminue rapidement en remontant le ZMW : seuls les nucléotides incorporés pendant la polymérisation fournissent des salves de signal fluorescent en temps réel.
  • Le séquençage de l'ADN des nanopores tel qu'il est employé dans le séquenceur MinION de l'ONT. L'ADN double brin est dénaturé par une enzyme qui fait passer l'un des brins (ADNss) par un nanopore biologique intégré dans une membrane synthétique, à travers laquelle une tension est appliquée. Lorsque l'ADNss passe à travers le nanopore, les différentes bases empêchent le flux ionique de manière distincte, ce qui permet de déduire la séquence de la molécule en surveillant le courant à chaque canal.

CRISPR-Cas9 et l’édition de génôme

Depuis la première publication en 1987 du mécanisme CRISPR par une équipe d’Osaka University, la méthode d’édition de gènes connue sous le nom de CRISPR/Cas 9 a fait beaucoup de chemin.

Qu’est-ce que CRISPR/Cas, comment cela fonctionne, et quelles sont les étapes pour faire de l’édition de génôme avec cet outil ?

CRISPR correspond à un type de séquence d’ADN très particulier d’un des gènes d’Escherichia coli : Il s’agit de 5 courtes séquences répétées, séparées par des séquences courtes non-répétées (des "spacers"), d’où son nom : "clustered regularly inter-spaced short palindromic repeats", ou CRISPR.

Les gènes Cas codent pour une famille d’enzyme coupant l’ADN. Il a été décrit en 2008 que les bactéries intégrent l’ADN de virus à l’endroit de ces « spacers ». Suite à cette intégration, les bactéries acquièrent la capacité à reconnaitre et à guider l’enzyme Cas à couper l’ADN virale, et donc à le désactiver. En 2012, une équipe publie dans Science comment le système CRISPR-Cas9 peut être utilisé pour couper n’importe quel ADN.

Les étapes pour utiliser la méthode sont les suivantes :

  1. Choisir le gène à modifier et obtenir sa séquence
  2. Sélectionner l’endonucléase à utiliser : Cas9, Cas12, Cpf1, etc.
  3. Construire le Guide ARN (gRNA) à l’aide d’outils comme Benchling
  4. Assembler le vecteur guide in silico, en choisissant le vecteur le plus approprié, par exemple un vecteur ayant déjà servi pour l’édition d’un gène
  5. Cloner le vecteur guide contenant : un plasmid « charpente » (backbone), le gène Cas9, la séquence pour le gRNA
  6. Insérer le vecteur dans les cellules à modifier, par transfection, transformation, ou infection virale
Le futur de la technologie est clairement vers l’amélioration du processus. La technologie est encore à ses balbutiements, tant au niveau technique (de nombreux cas ont montré les limites en termes de spécificité) qu’au niveau éthique (des manipulations sur embryons chimériques humains sont soumises à licenses). Des acteurs de l’ingénierie génétique développent les prochaines versions du système CRISPR/Cas.

Types de prestataires

Deux catégories majeures de prestataires en génomique :

Les plateformes académiques

Les plateformes académiques sont sollicitées pour le séquençage nécessitant le développement ou l’adaptation d’une méthode. Les séquenceurs étant très onéreux, les structures académiques se regroupent pour les financer. Le service est rendu par une plateforme technologique disponible auprès de structures externes comme les instituts de recherche et les sociétés.

Les sociétés de service

Les sociétés de service en génomique proposent des services adaptés aux demandes de clients privés ou publiques : séquençage, édition de génomes, microarray, développement de méthode. Elles peuvent être très spécialisées (sur une technologie ou un type d’application), ou généralistes, et peuvent valider des méthodes comme la qPCR, en utilisant les principes GLP (good laboratory practice).

L’ère post-génomique

L’ère de la génomique est une période qui s’étale de la découverte de l’ADN par Watson et Crick et qui d’achève avec le séquençage entier du génome humain. Ce projet, qui a débuté à la fin des années 80 et pris fin en 2003, ambitionnait d’apporter les réponses à toutes les questions liées au fonctionnement de nos cellules.

Loin d’avoir répondu à ces attentes, le projet a mis en avant un niveau supérieur de complexité quant aux mécanismes qui régule le comportement de nos cellules et l’expression de nos gènes. L’ère de la poste génomique est alors apparue, apportant avec elle tous les groupes de sciences « omique » : protéomique, métabolomique, transcriptomique etc.

La science sous l’ère de la post génomique s’attache donc à déterminer quand et dans quelles conditions un gène s’exprime. Ces études visent à comprendre l’organisation des réseaux de gènes, les interactions ADN/ADN, protéine/ADN ou encore protéine/ARN qui aboutissent à l’expression de ces gènes. Cette ère a également permis l’émergence de la Bioinformatique dont le but est de modéliser in silico les réseaux d’interactions pour aboutir, un jour peut-être, à une cellule vivante virtuelle.

Les technologies utilisées

  • Techniques de clonage moléculaire
  • Extraction d’acide nucléiques
  • PCR, qPCR, dPCR
  • Séquenceur Sanger et NGS
  • Microarray
  • CRISPR/Cas9 et autres technologies d’édition de gènes

Tarifs estimés pour ce type de prestation

Le séquençage varie typiquement en fonction de la taille de la séquence et peut aller de quelques dizaines d’euros (séquençage Sanger) à quelques milliers (NGS sur large génome entier).
La PCR quantitative requiert une phase de mise au point, entre 3 000 € et 10 000 € par gène, selon la méthode utilisée (sondes vs fluorophore comme le SYBR® Green ; simplex vs multiplex, qPCR vs dPCR).
La modification d’une lignée par CRIPSR/Cas9 est estimée entre 5 000€ - 10 000 €

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